TH1小鼠调节T细胞系的应用及培养操作步骤！
小杨 / 2024-02-06 09:41:31
一、背景
TH1小鼠调节T细胞系是一种细胞系，来源于小鼠的调节T细胞，具有上皮细胞样的形态特征。这种细胞系通常在贴壁条件下生长，可以通过1:2-1:3的传代比例进行传代培养，每周换液2-3次。TH1小鼠调节T细胞系可以用于免疫学、药理学和毒理学等方面的研究，以了解调节T细胞在免疫应答、肿瘤发生和感染等方面的作用和功能。
TH1(辅助T细胞1型)是一种T细胞亚型，主要在细胞免疫反应中发挥作用。它们通过分泌干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)来激活巨噬细胞和其他免疫细胞。
TH1小鼠调节T细胞系是指在特定的实验条件下，研究者试图在小鼠体内产生或调节的TH1和调节T细胞。这些实验通常是为了研究这两种细胞在特定疾病或条件下的功能和相互作用。
1)复苏TH1小鼠调节T细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)TH1小鼠调节T细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)TH1小鼠调节T细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
通过观察针刺对RA小鼠关节炎性症状的改善情况,检测针刺后RA小鼠外周血Treg细胞的表达及Th1、Th2细胞因子的分化状态,探讨针刺后Treg细胞对TH1小鼠调节T细胞系/Th2细胞分化格局的影响,以期为针刺改善RA关节炎的机理提供依据。
方法：将24只健康雄性Wistar小鼠随机分为空白组、模型组和针刺组。模型组、针刺组两组采用牛Ⅱ型胶原和弗氏佐剂制备类风湿性关节炎模型,空白组常规饲养。针刺组选取小鼠双侧的“肾俞”“足三里”穴运用毫针干预。每天毫针针刺30分钟,连续针刺6天为一疗程,共针刺3个疗程,每治疗一疗程结束后休息1天。余各组同针刺组束缚但不治疗。在造模前后、治疗前后,即(第1、14、21、42天)分别测量小鼠的体质量与足容积、并观测小鼠的关节炎症指数(AI)评分。取膝关节组织,用HE染色法,观察踝关节组织形态学的变化;采用联酶免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠外周血中TH1小鼠调节T细胞系、IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α的含量;用聚合酶链反应(PCR)实验方法,检测细胞中IL-2、IFN-γ、IL-4基因表达水平;用流式细胞术(FCM)检测针刺对Treg细胞标记分子Foxp3表达的影响。
结果：
1、小鼠体质量、足容积、AI评分及关节滑膜组织病理学变化:与空白组比较,模型组小鼠体质量减轻(P<0.01);足容积明显提高(P<0.01);AI评分亦提高明显(P<0.01);关节软骨损伤、滑膜组织炎细胞侵润、纤维组织增生皆显著提高(P<0.01),滑膜细胞和巨噬细胞存在增生(P<0.05)。与模型组相比,针刺组小鼠体质量增加明显(P<0.05);足容积减小(P<0.05);AI评分降低(P<0.01);炎细胞侵润降低(P<0.05),纤维组织增生明显减轻(P<0.01)。
2、RA小鼠外周血中TH1小鼠调节T细胞系、Th2相关细胞因子浓度及基因表达结果:与空白组比较,模型组外周血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度均增加,IL-4浓度降低(P<0.01);细胞中IL-2、IFN-γ基因表达升高(P<0.05),IL-4基因表达明显降低(P<0.01);与模型组相比,针刺组外周血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度均较低(P<0.05),IL-4浓度增加(P<0.05);细胞中IL-2、IFN-γ基因表达降低(P<0.05),IL-4基因表达无明显差异(P>0.05)。
3、RA小鼠外周血中Treg细胞标记分子Foxp3的表达结果:与模型组相比,针刺组CD4+CD25+Foxp3+阳性表达升高(P<0.01)。
结论：
1、针刺能改善RA小鼠关节炎性症状,能使小鼠体质量的增加,膝关节的红肿消退,AI评分降低,并能减少小鼠膝关节组织中炎性细胞的侵润和纤维组织的增生,改善滑膜的损伤和骨关节的破坏。
2、针刺可以降低小鼠血清中Th1炎症细胞因子含量及基因表达、提高Th2标志性细胞因子含量和Treg细胞标记分子Foxp3表达。由此推测,针刺可能通过刺激Treg细胞的表达,改善TH1小鼠调节T细胞系/Th2细胞的分化失衡,减轻膝关节的炎症反应。这可能是针刺治疗本病的机理组成部分之一。
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