酵母RNA提取试剂盒的特点与使用及注意事项有哪些？
小杨 / 2024-06-15 09:22:35
一、概述
本试剂盒适用于酵母RNA的提取，酵母细胞经溶壁酶处理去除细胞壁后,独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后,RNA选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
二、产品特点
1、离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2、不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3、快速，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。
4、多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留,可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。
三、注意事项
1、次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入。
2、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm 的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3、需要自备乙醇，β-巯基乙醇，水浴锅。
4、裂解液RLT 和去蛋白液RW1 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5、关于DNA 的微量残留：
一般情况下，一般说来任何总RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA 的微量残留,本试剂盒由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA 残留（一般电泳EB 染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA 表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时：
1)选用跨内含子的引物,以穿过mRNA 中的连接区,这样DNA 就不能作为模板参与扩增反应。
2)选择基因组DNA 和cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。
3)将RNA 提取物用RNase-free 的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I 处理后的RNA 清洁(cleanup)。
4)在步骤去蛋白液RW1 漂洗前，直接在吸附柱 上进行DNase I 处理。
6、RNA 纯度及浓度检测：
完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE 电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中rRNA 亮度应为次大rRNA 亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free 水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
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