微生物菌种保藏的目的与原理及对应的活化技术！
小杨 / 2024-06-19 09:06:55
百欧博伟生物：保藏方法不一样，活化方法就不一样，都是一一对应的。我们不能强制性的张冠李戴，那样做出来试验效果会有一定折扣。为了这个折扣，我们有必要探讨一下菌种保藏方法和不同保藏方法对应的活化方法。
一、微生物菌种保藏的目的
尽可能的保持菌种的原有性状和生理活性，不变异、不死亡、不污染、不退化。
菌种保藏最重要的目的就在于如何保持优良菌种其优良性状的稳定，满足生产的实际需要。
二、微生物菌种保藏的原理
1、使微生物的代谢作用降至极低限度，使其处于不活跃的休眠状态。通过降低微生物体内的代谢，抑制生长繁殖，从而延长菌种的生命，减少变异。
2、从微生物本身来说，就是要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用他们的休眠体，比如说芽孢、孢子等。从环境条件来说，就是要创造一个适合长期休眠的环境条件，比如低温、干燥、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。大多数菌种的保藏方法都是根据这些因素或其中部分因素而设计的。
3、微生物具有易异变的特性，在保藏过程必须使微生物代谢处于最不活跃的状态但又不死亡，才能在一定的时间内使其不发生变异或少发生变异而又保持生命活力。
三、菌种保藏方法和不同保藏方法对应的活化方法
（一）斜面保藏法和活化
1、斜面保藏法操作步骤
斜面保藏法的原理：将斜面保存在4℃条件下，创造低温环境，降低菌种活力。再加上斜面接种面积大，开口小，也相应地减少了污染的机会。
(1)制备斜面
斜面制备好后，最好在恒温培养箱中培养两天，检验是否有污染。
(2)斜面接种
平板转接斜面和斜面转接斜面，都是没有问题，但一定要确保保藏的菌种没有污染后，再进行转接。
(3)适用对象
细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等的短期保藏。
一般情况下，近期两个月内不可能使用、也有可能使用的菌种，都可以采用斜面保藏法保藏。
(4)保藏期
一般保藏期为两个月，最好不超过两个月。时间过长，斜面脱水，菌种也会脱水死亡。
但也要根据情况进行判断，比如说，斜面没有什么变化，菌种也没有明显污染，也可以继续保藏，但最好转接出来较为妥当。
一般情况，细菌一个月，酵母菌、放线菌等两个月。
(5)优点
操作简便，没有复杂的工序，不需要特殊设备，成本低，容易观察，随时观察菌种的状态，复苏方便。
制作斜面一般用玻璃试管，比较透明，可以定期观察菌种变化，如果发现污染或斜面脱水等状况，立即转种。
(6)缺点
保藏期短，菌种容易变异，易污染。
因斜面上只有固体培养基，没有特殊的保护措施，所以培养基本身会发生变化，因保藏期短，就需要经常传代，传代过程中增加污染的机会。
2、斜面保藏菌种活化
斜面保藏法活化菌种比较简单，直接用接种环挑取单菌落，采用“Z”字划线法在斜面上连续划线，放置于恒温培养箱中培养，待培养完成保存至4℃保存。
（二）甘油管保藏法和活化
1、甘油管保藏法操作步骤
甘油管保藏是实验室常用的菌种保藏方法，它的原理在于，一定浓度的甘油，可以降低水的结冰温度，有效地防止细胞内部形成冰晶，甘油还可以与细胞内部分子结合，从而形成细胞的保护层，起到保护细胞的作用。此外，甘油还是一种有机碳源，可以为细胞提供一定量的碳源和能源，使其保持活力状态。
(1)准备甘油
甘油比较粘稠，一般采用质量比配制即可。
甘油管保藏法中，甘油的终浓度20%-30%即可。
值得注意的是，配好后一定要混匀，甘油密度比较大，会沉淀到底部，如果不混匀，灭菌效果可能不太好。
(2)甘油管保藏
液体菌种：将培养好的液体菌种和甘油按比例混匀，一般甘油的终浓度20%-30%。
我一般使用50%甘油和菌液1:1混匀，-80℃保藏即可。
平板或斜面菌种：用无菌水重悬菌种后，与50%甘油1:1混匀，-80℃保藏即可。
通常使用甘油的终浓度在20%~30%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，质粒会很容易丢失，甘油浓度太低起不到作用，太高又会影响菌种活性。
(3)适用对象
几乎适用所有菌种保藏，中长期保藏。
半年到一年内可能用到的菌种。
(4)保藏时间
一般保藏时间为一年。在实际操作中，一年以上也没问题。
(5)优点
操作简单，保藏期较长，菌种不容易发生变异。
(6)缺点
不容易观察，不易监测菌种变化，不宜反复冻融。
2、甘油管菌种活化
将甘油管从-80℃取出，融化后，直接用接种环挑取一环，采用划线法在固体培养基上划线，适宜温度下倒置培养即可。或者用无菌水适当稀释后涂布至平板培养基中，培养。
小提示：
一种说法，甘油管保藏菌种需要“慢冻快化”，即-80℃保藏前，先-20℃预冻，再放入-80℃保藏；取出使用时，直接放入37℃快速融化后使用。
另一种说法，甘油管保藏菌种需要“慢冻慢化”，即-80℃保藏前，先-20℃预冻，再放入-80℃保藏；取出使用时，逐级融化后使用。
实际使用时，甘油管直接-80℃冷冻保藏，使用时取出来直接用手捂热使用，也是符合第一种说法的。
效果到底哪种方式好，还需要继续研究，等待进一步数据。
（三）穿刺保藏法和活化
1、穿刺保藏法操作步骤
穿刺保藏法原理是缺氧和低温，即菌种保存在半固体培养基内部，造成缺氧环境，然后保存于4℃，延长菌种时间。
(1)制备半固体培养基
半固体培养基跟固体培养基的区别在于琼脂粉含量不同，前者琼脂粉含量1%，后者含量1.5%-2%。
半固体培养基添加至无菌试管约1/3处，营养不宜太丰富。
值得注意的是，半固体培养基配制好后需要竖起来，不需要摆斜面。
(2)接种
用接种针挑取少量细菌，从半固体培养基的中心垂直刺入，直至接近半固体培养基1/2处自上而下穿刺，不要穿透，然后沿原穿刺线将接种针退出，穿入培养基若干次，放置于恒温培养箱中培养，待微生物生长良好后，用2毫米无菌液体石蜡覆盖，以创造缺氧环境并4℃保藏。
(3)保藏时间
一般3-6月后转种。
有的菌种保存时间至少可以达到1 年，有的菌种甚至能达到20 年之久。
(4)适用对象
适用于工程大肠杆菌等细菌，操作简便，保存时间较长。
(5)优点
操作简便，保存时间比斜面保藏法长。
(6)缺点
比较耗费空间，不便于携带。
2、穿刺保藏菌种活化
用接种环沿着菌种方向穿入，挑取菌种，转接至斜面上或平板培养基上，或加入无菌水摇晃，稀释涂布即可。
（四）液体石蜡保藏法
液体石蜡保藏法实际上是斜面保藏法的一种改进形式。它的原理基于斜面保藏菌的基础上，覆盖一层液体石蜡，创造缺氧环境而保存于4℃。
1、液体石蜡保藏法
(1)准备液体石蜡
根据需要，将液体石蜡进行分装密封，放置于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌30min，灭菌完成后放置于40℃恒温箱中蒸发水分，约4天，或105℃烘箱中1h，待水分蒸发完全后，备用。
(2)制备斜面菌种
(3)封液体石蜡
将无菌干燥的液体石蜡注入上述培养好的斜面上，加入石蜡的量以高于斜面顶端1cm为宜，再将试管密封，直立于4℃左右冷藏保存。
覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。要定期添加石蜡保证斜面处于液面以下。
(4)保藏时间
保藏时间至少可以达到1年，甚至更长。
一般情况，不产芽孢细菌保藏1年，芽孢菌、放线菌、霉菌可保藏2年，酵母菌可保藏1-2年。
(5)对象
细菌，酵母菌，放线菌等。
(6)优点
保藏时间较斜面保藏法长，操作简便。
(7)缺点
需要直立放置，比较耗费空间，不便于携带。
2、液体石蜡保藏菌种活化
将保藏的斜面取出来，用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种，适当在试管内壁轻点几下，减少石蜡量，然后采用划线法接种于新鲜平板上培养，待生长良好，再次传代，培养。
3、注意事项
(1)液体石蜡易燃，必须注意火灾。
(2)移植菌种时，接种针上带有石蜡和菌体，火焰灭菌时易飞贱、爆发，严防感染。
(3)由于取出的菌种带有一定量的液体石蜡，生长较慢且有粘性，因此，需要传代2次。
（五）沙土管保藏法
沙土管干燥保藏法的原理是在沙土干燥条件下微生物细胞代谢活动减缓，繁殖速度受到抑制，这样减少菌株突变，延长菌株存活时间。将培养好的菌种与无菌沙土混合，使菌体吸附在沙土载体上，干燥后保存。
1、沙土管保藏法
(1)处理沙土
将沙和土洗净、烘干、过40目筛子，将沙与土以2:1的比例混合、分装（每管1g沙土），灭菌，烘干。
(2)制备孢子悬液
当孢子成熟后，用无菌水洗下制成孢子悬液，备用。
(3)抽干、封口
将孢子悬液加入无菌的沙土管中，每管0.5mL，通过减压干燥的方式去除沙土管中水分，直至水分被抽干，最后用石蜡或橡胶塞封口。
沙土管主要是通过创造干燥和寡营养的条件来保藏菌种。操作的时候应该注意抽干一步务必要快，尽量在12h内完成，防止孢子萌发，降低保藏效果。
(4)保藏时间
两年左右，根据菌种特性，保藏时间可能更长。
(5)适用对象
适用于能产生孢子的微生物，如霉菌、放线菌，能形成芽孢的芽孢杆菌也可以采用该方法。
(6)优点
保藏效果好，适用性也较广泛，在抗生素生产工厂应用广泛。
(7)缺点
不能保藏营养细胞。
2、沙土管保藏菌种活化
取出少量沙土颗粒，放入适宜的液体培养基内培养，或在固体培养基表面涂抹后培养。
3、注意事项
(1)需要选择适合的沙土材料，排水性好、颗粒细小均匀、无害菌和病原菌，并且不含明显异味。
(2)严格消毒和无菌操作。
（六）冷冻真空干燥保藏法
冷冻真空干燥保藏法的原理是将菌种冷冻，在减压下利用升华作用去除水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而使菌种长期维持存活的状态。
1、冷冻真空干燥保藏法
(1)制备菌悬液
将处于成熟期的微生物培养物悬浮于无菌的脱脂奶粉或者海藻糖等保护剂中制成浓菌液，分装到无菌的安瓿瓶中。
(2)抽真空，干燥
将上述安瓿瓶放置于低温冰箱中冷冻，达到预定温度后对浓菌液进行冷冻干燥处理，之后在真空状态下融封安瓿瓶，于20℃保藏。
(3)保藏时间
五到十年，因保藏期较长，一定要标记清楚，以免遗忘。
(4)适用对象
适用于大批量菌种的长期保存。该保藏法是目前适用范围最广，保藏效果最好的方法，如果需要长期保藏就选择这种方法。
(5)优点
适用范围广，保藏效果好，存活率高，变异小，便于携带。
(6)缺点
因涉及到冷冻抽真空设备，一般实验室不具备条件，需要到专门保藏机构保藏，成本增加。
2、冷冻真空干燥保藏菌种活化
(1)安瓿瓶开封
先用浸过75%酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用酒精灯火焰将安瓿管顶端适度加热，然后用移液器取少量无菌水，将无菌水滴至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂，最后用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。
(2)复活方法
先用移液器吸取0.3-0.5mL适宜的液体培养基，滴人安瓿管内，轻轻振荡，使菌体溶解呈悬浮状，然后取0.1-0.2mL菌体悬浮液，移植于适宜的斜面或平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，适宜的温度下培养。
（七）液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法主要是利用微生物在低于-130°C的低温下新陈代谢趋于停止的原理，在液氮中（-196°C的超低温下）有效地进行菌种保藏的方法。
1、液氮超低温保藏法操作步骤
(1)制备菌悬液
离心收集对数生长期微生物细胞，用新鲜的培养基重悬微生物细胞。
(2)添加保护剂
一般使用20%甘油和上述菌悬液等体积混匀，加入无菌的安瓿瓶中。
(3)冷藏
将上述安瓿瓶缓慢预冷，最后移至液氮罐中的液相（-196℃）或气象相（-156℃）作长期超低温保藏。
(4)对象
所有微生物。
(5)保藏时间
15年以上或更长。
(6)优点
适用性广，几乎适用于所有微生物，保藏期长。
(7)缺点
需要液氮罐等特殊设备，且管理费用高、操作较复杂、携带不便。
四、菌种保藏共同点
1、严格无菌操作。
2、所保藏的微生物在保藏时处于良好的状态。
3、防止退化的发生。所以，保藏期一到，准备转接重新保种。
总之，菌种保藏是微生物学的重中之重，根据微生物的习性和使用时间，选择合适的保藏方法。
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