一、背景
小鼠胰腺Β细胞含SV40大T抗原，适用于转染，源于10周雌性小鼠。
二、小鼠胰腺Β细胞培养操作
1)复苏小鼠胰腺Β细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠胰腺Β细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)小鼠胰腺Β细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
小鼠胰腺Β细胞可以用于Exendin-4对氧化应激诱导小鼠胰腺β细胞凋亡的保护作用及其机制研究：
探讨NF-κB-iNOS-NO信号通路在第三丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)诱导小鼠胰腺β细胞株MIN6细胞凋亡中的作用;在此基础上,进一步研究GLP-1受体激动剂Exendin-4对t-BHP诱导的MIN6细胞凋亡的作用及其可能的机制。
方法：选用小鼠β细胞株MIN6细胞为研究对象,用t-BHP诱导刺激,模拟体外β细胞氧化应激损伤后的细胞凋亡模型,通过MTT观察t-BHP作用后细胞的存活率;AO-EB染色荧光显微镜观测细胞凋亡形态,Annexin-Ⅴ-PI染色流式细胞技术测定细胞凋亡率,Griess化学显色法检测氧化损伤过程中细胞内一氧化氮(NO)水平,同时应用Western blot技术检测胞浆诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白、胞浆及胞核核因子-κB片断p65(NF-κB p65)蛋白表达水平的变化。
在此基础上,分别应用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、iNOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester,L-NAME)预处理并检测上述指标,以明确NF-κB-iNOS-NO信号通路在t-BHP诱导MIN6细胞凋亡中的作用;随后用不同浓度(10,100 nmol/L)的Exendin-4预处理,观察Exendin-4对t-BHP诱导MIN6细胞凋亡的保护作用,并进一步研究Exendin-4能否通过NF-κB-iNOS-NO通路影响t-BHP诱导MIN6细胞发生凋亡性损伤。
结果：MTT显示tBHP(12.5200μmol/L)作用不同时间后可明显抑制MIN6细胞的生长,并呈现一定的时效和量效关系;AO-EB荧光显微镜及Annexin-Ⅴ-PI双染流式细胞检测证实25μmol/L浓度的tBHP处理60min后,诱导β细胞的损伤作用以凋亡为主,而更高浓度的tBHP使细胞由凋亡转向坏死。25μmol/L tBHP处理60min后同时引起细胞NO水平明显升高;该浓度的tBHP处理30min时胞浆iNOS蛋白达高峰水平;而该浓度的tBHP作用20min时胞核NF-κB活化片断p65蛋白达高峰水平;iNOS抑制剂L-NAME(500μmol/L)或抗氧化剂NAC(10mmol/L)预处理均可明显抑制tBHP诱导的β细胞凋亡及NO水平的增高。不同浓度的Exendin-4预处理预处理18h同样抑制tBHP诱导的β细胞凋亡及NO水平的增高,并呈现一定的剂量依赖性,并且Exendin-4能抑制tBHP诱导的β细胞胞核NF-κB p65及胞浆iNOS蛋白的表达水平。
结论：
(1)t-BHP可诱导胰岛β细胞发生凋亡性损伤,在此过程中伴随细胞内NO水平的增加;
(2)氧化应激-NF-κB-iNOS-NO-凋亡通路可能是t-BHP诱导胰岛β细胞凋亡的重要通路之一;
(3)GLP-1受体激动剂Exendin-4可以剂量依赖性地抑制t-BHP诱导胰岛β细胞的凋亡,同时抑制细胞NO水平;
(4)Exendin-4可能通过抑制细胞内NF-κB活化、胞浆iNOS表达水平来抑制NO水平,最终减轻氧化应激损伤诱导的β细胞凋亡。Exendin-4在胰腺β细胞保护治疗中具有潜在的应用价值。
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