一、背景
铅黄肠球菌PCR试剂盒是一种专门用于检测铅黄肠球菌的体外诊断试剂。它采用了聚合酶链式反应（PCR）技术，能够在短时间内快速、准确地检测出铅黄肠球菌。
铅黄肠球菌PCR试剂盒的主要成分包括PCR反应液、DNA模板、引物、酶等。其中，PCR反应液是PCR反应的基础，包含PCR反应所需的各种成分，如缓冲液、离子、酶等。DNA模板是含有铅黄肠球菌特异性基因序列的DNA片段，用于扩增出特异性片段。引物是一段与DNA模板特异性结合的短序列，用于启动PCR反应。酶是热稳定的DNA聚合酶，用于催化DNA合成。
使用铅黄肠球菌PCR试剂盒时，需要将DNA模板、引物和PCR反应液混合后进行PCR反应。在适宜的温度和条件下，引物与DNA模板特异性结合，并通过酶的催化进行DNA合成，最终得到大量的特异性DNA片段。通过凝胶电泳等技术对这些片段进行检测和分析，可以确定是否存在铅黄肠球菌。
二、铅黄肠球菌PCR试剂盒产品及特点
因此快速灵敏检测铅黄肠球菌具有重要意义。本产品就是为此目的根据PCR原理开发的试剂盒，它具有下列特点：
1、即开即用，用户只需要提供DNA模板。
2、引物经过精心优化，专一性强，只扩增铅黄肠球菌，与其他植物没有交叉反应。
3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4、PCR mix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。
5、本试剂盒足够做40μL体系的PCR 50次，但只能用于科研。
三、应用
铅黄肠球菌PCR试剂盒可以用于林麝肺源铅黄肠球菌FML1805的分离、全基因组测序分析及其蜂胶佐剂灭活疫苗的试制：
从病死林麝肺脏中分离出一株铅黄肠球菌,命名为FML1805。对此株FML1805进行生理生化鉴定和16S r RNA测序分析后,进行了小鼠致病性试验、全基因组测序分析及ANI计算分析,同时试制了蜂胶佐剂灭活疫苗。疫苗通过动物安全试验后分别注射家兔与林麝,并用间接ELISA方法检测家兔与林麝三免后84 d的血清抗体效价。
主要试验结果如下：
1、林麝肺源铅黄肠球菌的分离及致病性试验结合分离菌株的生化试验及铅黄肠球菌PCR试剂盒16S r RNA的测定比对,死亡林麝肺脏分离菌株为肠球菌属,并且与铅黄肠球菌16S r RNA同源性最高;该分离菌株可以引起小鼠发病,剖检可见小鼠肺部病变较为明显、其余脏器也有不同程度充血肿大,制备病理切片后观察可发现:小鼠心、肝、脾、肺、肾均有不同程度组织病理变化。分离菌株对小鼠半数致死量为5.9×108CFU/m L;药敏试验结果显示分离菌株对万古霉素耐药、氨基糖苷类几乎耐药、头孢类敏感。
2、全基因组序列测定及分析结果全基因组序列测定结果显示此分离菌株基因组大小为5321641 bp,包含6521个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。对其进行ANI分析计算后显示与Enterococcus casseliflavus EC20全基因组平均序列一致性达到了99.54%,可判断此分离菌株为铅黄肠球菌。将测得的全基因组数据成功上传至NCBI,命名为FML1805,登录号:WEKZ00000000;对全基因组分析结果显示含有18个与耐药相关的基因及16个与毒力相关的基因。
3、蜂胶佐剂灭活疫苗的试制本研究用天然蜂胶作为佐剂研制灭活疫苗,通过动物安全试验后接种于家兔和林麝体内。间接ELISA测定家兔和林麝三免后84 d内的血清抗体水平,用测得阳性血清OD600nm值(P)比上阴性血清OD600nm值(N)大于等于2.1时的最小血清稀释倍数来表示血清抗体水平,结果显示:家兔在完成免疫程序84 d内的血清抗体效价稳定在3100倍左右;林麝在完成免疫程序84 d内的血清抗体效价稳定在1500倍左右。
综上,本试验从林麝肺脏分离鉴定出一株革兰氏阳性球菌,命名为FML1805。测定并分析FML1805全基因组后确定此菌株为耐万古霉素的铅黄肠球菌变异株,并研究了此菌株的致病性和耐药机制。最后试制蜂胶佐剂灭活疫苗,为铅黄肠球菌的临床治疗及其预防工作取得了铺垫。
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