微生物在家庭环境下进行组织培养的探讨与建议！
小杨 / 2024-05-08 09:01:37
百欧博伟生物：植物组织培养技术，尤其是快速繁殖，并非只有专业人员和专业实验室才能够完成的。作为对多肉植物和组织培养有着浓厚兴趣的爱好者，在充分利用家庭条件的基础上，同样可以制备出自己的试管苗来的。在我们进行多肉植物的栽培中认识到，一些比较名贵的园艺品种，比如：万象、玉扇、寿、高纹鹰爪等十二卷属品种，还是缤纷橄榄、何鲁牵牛等块茎类植物，甚至于星球属、岩牡丹属等等，这些植物的常规繁殖系数很低，他们都可以采用组织培养来解决其繁殖问题，并且可以得到相当数量的幼苗。对于奇想天外等种子萌发困难的植物，同样可以借助组织培养来进行无菌播种。在进行组织培养过程中，不但可以对培养的植物有更深一层的认识，对常规的栽培有着相当大的意义。许多搞组织培养的专家，最初都不是专业学组培的，就是凭着兴趣和探索精神取得辉煌成绩的。关键是，爱好者有着浓厚的兴趣，非凡的观察力和细致入微的操作，这些都可以弥补非专业的缺陷，并且可以充分利用日常生活中的各种可利用资源，这些就足以让爱好者在家庭环境下完成组织培养了。同时这也不仅仅满足了自己的兴趣，还可以有一定的经济收益，甚至可以有所创新和发明。
一、如何解决场地和基本设备
进行组织培养，没有一定的设备是无法开展的。正规实验室的组织培养设备是昂贵的，不适合家庭消费，但如果能有途径买到廉价的实验室设备，那就在好不过了。如果没有办法搞到实验室设备，就不妨动手自己制作一些简单的设备。
1、无菌操作的主要设备——接种箱和压力锅：
接种箱：植物组织培养的主题操作需要在一个相对密闭的无菌环境中进行。那么说我们首先要创造一个密闭的环境，可以利用一些木料、塑料板、有机玻璃、铝合金骨架等等廉价的材料，动手粘合一个小巧的接种箱。具体的参数可以找一本“食用菌栽培”的书籍，模仿种蘑菇的接种箱做一个即可。需要注意的是，组织培养的接种箱的密闭性要求比较高，尽量避免腐朽的木材和易生锈的材料，箱子的顶端按放两盏灯：20w的紫外线灯和20w的日光灯。箱体的周边尽量采用玻璃材料，因为这样便于观察，有时候接种箱还可以借用为培养箱，周边采用玻璃材料更方便于观察和培养。
高压锅：主要用来对培养基和其他材料的灭菌。在实验室通常使用医用高压灭菌器，然而在家庭要充分利用厨房使用的高压锅，高压锅的压力要低于灭菌器，但是适当延长灭菌时间，还是可以取得较好的效果的。比如：对培养基灭菌40分钟就基本上可以达到灭菌效果（灭菌器是20分钟）；无菌水采用间歇灭菌法，先用高压锅压40分钟，放置24小时，再压20分钟即可达到效果。
2、场地：
这个就因人而易了，总体的要求就是进行组织培养操作的地方要尽量无尘，减少空气流动，最好有一定的阳光。比如书房、写字间都可以用来进行无菌操作。
进行培养基的配制可以借用一下厨房，但所使用的器具必须和厨具分开。一般说，组织培养中的几乎全部化学物质对人体是无害的，除了少数激素类物质和灭菌剂。对于有毒害的物质，需要认真保管，以免发生危险。
3、辅助设备：
主要指冰箱，它是用来储存化学物质和培养基的。天平，可以采用感量在100克的托盘天平，甚至用中药的药衡都可以代替。培养架，这个就更简单了，采用铝合金-玻璃的培养箱既可以满足要求，如果日光不足，可配合日光灯补光等。
4、化学试剂：
化学试剂是不可缺少的，因为组织培养的核心就是培养基的成分，而并不是简单的无菌操作。一些用量较大的化学物质是有必要买的，比如大量元素（硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙等）、高锰酸钾、甲醛、酒精、白砂糖、琼脂等等。微量元素和有机复合物不需要购买，因为它们的用量很小，我们可以用蔬菜浸汁或者马铃薯浸汁来代替。激素是必不可少的，他们的称量需要借助分析天平，但这是家庭条件所不允许的，如果有条件可以借助关系单位代替配成母液，每次取一些使用即可。最好的办法是到农资商店（卖农药化肥的地方），它们一般出售农业用的激素，有的是用安瓿装的，按照一定的比例加入到培养基当中即可。近几年来，有些化学品公司开始生产植物组织培养基原粉，只需要称取一定量加水即可，很方便。比如泛生化学品公司生产的ms原粉，只需要称量40克，加1升水，用微波炉加热5分钟即可分装，相当简便。
消毒剂通常采用氯化汞（剧毒），如果不容易搞到，可以用漂白粉代替。调节酸碱度时，可以采用家庭常用的纯碱和白醋。
5、培养容器和玻璃仪器：
组织培养的容器要求并不高，只要玻璃颜色为透明色即可（钠玻璃不可以）。
我们可以到垃圾站去看看，捡回一些废旧的果酱瓶就可以了。比较好用的是阿香婆辣酱瓶，我们实验室也是采用的这种瓶子。瓶子的封口膜采用聚丙烯塑料即可，如果不好找到，可以采用微波炉专用的锡箔纸甚至方便面的袋子，折叠成双层，用橡皮圈固定即可。
其它玻璃仪器，比如烧杯、玻璃棒都可以用家庭的杯子和筷子代替；一些度量仪器，如量筒和移液管最好到玻璃仪器商店购买，恐怕花不了20元钱就可以配置一套相当棒的组培玻璃仪器。
6、其它：
还有一些用品是必需的。比如精密ph试纸（5.4~7.0），需要买一本，大约花1.5元即可搞定；酒精灯也不需要买，用墨水瓶配上一个玻璃环，再加上一个棉花芯，最后用农夫山泉矿泉水的瓶盖做灯冒，这样的酒精灯很小巧，适合接种箱使用。刀子剪子镊子是必需的，到花市的工具摊位上，花10元钱全部搞定，注意选比较小巧的工具。
关于用水，按理说应该使用蒸馏水，但是我们家庭饮用的纯净水比蒸馏水还要纯，那么说借用一些饮用水就可以了。我们曾经采用康师傅纯净水进行动物细胞的培养，效果都是很不错的，更何况于植物细胞培养了。
以上是组织培养的基本设备和试剂，主要突出了他们相关的替代品，因为作为组织培养中的快速繁殖，它的要求是相当低的。我们的家庭培养和工厂化是不同的，工厂化生产组培苗要追求高增殖率，所以它的要求就比较精细和标准。我们的家庭培养则不需要那么准确，只要达到培养成功的目的即可。当然，如果想提高增殖倍率和试管苗的品质，必须尽量贴近实验室的用具和器材，代用品总是有一定的缺陷的。
二、进行组织培养前的准备
1、培养容器和玻璃仪器的准备：
进行培养基的配制首先要准备好培养瓶和配制使用的玻璃仪器。培养瓶一般使用各种果酱瓶，要先用洗洁精浸泡瓶子4~8小时，再用流水冲洗数次。其他的玻璃仪器同样需要这样清洁，直到玻璃壁上不挂水珠而是成为水膜为止。清洗完毕的玻璃容器要倒扣，空去瓶内的水。
清洗干净的容器要注意防尘，尽量放置在玻璃柜中。更简单的是用干净的毛巾将容器盖住。
移液管要用吸球来清洗，反复用蒸馏水吹吸直到洁净为止，将移液管放置在一个长筒中，便于使用。一般移液管只能使用一次，即要清洗，所以有多必要准备几只移液管，建议：10ml/2支，5ml/2支，1ml/5支。
2、培养基的配制：
经典的组织培养用培养基是ms配方，其基本上划分为：大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、植物激素、糖和支持物。这些成分的用量都在毫克级，用普通天平是难以称量的，为了解决这个问题，我们可以按比例放大各成分的用量配制成母液，使用的时候按一定比例加入即可。
下面我将一种ms培养基的母液配制方案公布如下：
大量元素：硝酸铵66.0克；
硝酸钾76.0克；
无水氯化钙13.3克；
七水硫酸镁14.8克；
磷酸二氢钾6.8克。
以上分别溶解后合并定容到1升，每配制1升标准ms培养基取25毫升。
铁盐：七水硫酸亚铁5.56克；
乙二胺四乙酸二钠（edtana）7.46克。
以上两种分别加热溶解，混合，定容到1升，调整ph到5.5以下，每配制一升ms取5毫升。
微量元素和有机复合物的用量过于微小，为了简便我们可以用蔬菜提取液或者马铃薯提取液代替。通常我们习惯用100克菠菜加100ml的水煮沸10分钟，过滤留滤液，每配制1升ms培养基加入20~50毫升提取液。同样也可以使用带皮马铃薯100克加200毫升水煮沸15分钟，过滤留滤液，每升ms加入50~100毫升即可。
加入上述各组分后，每升ms培养基还需要加入白砂糖30克，琼脂7克。这里要说明的是，糖和琼脂都是可变的量，要根据需要调整。另外制作果冻用的卡拉胶也可以代替琼脂，透明度更好。
上述各成分加入后，定容到800毫升左右，用微波炉加热，直到琼脂全部溶解为止。此时加入所需的植物激素（通常配制成0.1%溶液，这样每取1毫升，换算到培养基中就是1ppm）。然后加水定容到1100毫升（1.1升），之所以多出0.1升是为了抵消分装和消毒中的损耗。最后用酸碱调整ph到5.8~6.0。
3、使用ms原粉配制培养基：
目前国内的一些化学品公司开发了简便的ms培养基原粉，大大简便了培养基的配制，根据不同公司的说明选择培养基的种类。下面就以泛生化学品公司的ms原粉为例：泛生化学品公司生产的ms培养基原粉，包括了大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖和支持物，他们的支持物是一种人工合成的半乳糖硫酸脂——polygal，这种物质作为支持物虽然提高了成本，但是无论是透明度还是强度都优于琼脂，更重要的是ploygal对组织的褐变有一定的抑制作用，对初学者尤为重要。一般称取ms原粉40克，加水800毫升，微波炉加热溶解，加入激素，定容到1100毫升（1.1升），调整ph值到5.8~6.0。
值得指出的是polygal还有一个特点，他对ph和灭菌时间的敏感性很强，如果培养基配制和灭菌出现问题，他会变色来提醒实验者培养基出现问题，这个也对初学者有一定的帮助。泛生公司也提供纯品polygal 供研究使用。
泛生公司的ms原粉价格大约是50元1000克，能制备20升ms培养基。这对于家庭做组培的爱好者来说，花50元钱可以使用一两年。
4、分装：
将配制好的培养基分装在培养容器中，注意要趁热分装，因为琼脂在40度以下就会凝固。每个培养瓶装培养基大约是瓶容积的1/6~1/5，注意不要将培养基挂在瓶的外壁，这样容易造成污染。分装后用聚丙烯薄膜或着方便面的袋子封口，用胶圈固定（胶圈尽量选择自行车的内胎，这种胶圈比较耐热）。
5、灭菌：
采用家庭压力锅消毒，建议到医疗器械用品商店买一些“灭菌效果试纸”，它们可以指示灭菌效果，当灭菌达到效果时会变色。把试纸和培养基同时放入锅内，加热到有大量蒸汽冒出，再加上压力伐，维持小火30~40分钟。
灭菌完毕后自然冷却，将培养基取出，放在阴凉无尘处备用。
6、接种箱的准备：
新制作的接种箱必须要清洁干净，尽量做到无死角。每次使用前2小时，将操作所需要的全部物品放入接种箱，再用一个小烧杯加入3~5克高锰酸钾放入接种箱内，在箱内向烧杯中倒入2~3毫升的甲醛溶液，大约几秒钟后会看到甲醛蒸汽出现，这样可以对接种箱内的所有物品进行初次消毒；同时打开紫外线灯照射。紫外线灯是高电压穿激汞蒸汽产生的，紫外线进行第二道灭菌，在紫外线照射大约15分钟后，会激发氧气形成臭氧，臭氧作为第三道灭菌防线，这样经过三次灭菌，接种箱基本上可以达到无菌标准。
在操作前15分钟内，向刚才蒸发甲醛用的烧杯中倒入5毫升浓氨水，因为甲醛对人体有毒害作用，氨水可以和甲醛形成一种叫做“六亚甲基四胺”的固体物质，从而中和了甲醛的刺激性蒸汽。这个时候紫外灯不要关掉，要继续照射，直到操作前5分钟关闭，维持黑暗5分钟，然后再打开日光灯进行操作。维持5分钟黑暗的原因是，紫外光对微生物的杀灭是作用于dna的胸腺嘧啶，形成四聚体，但是微生物具有一种光复活蛋白，可以在有可见光的环境下还原胸腺四聚体，而使微生物复活，这个作用叫做“光复活作用”，所以在关掉紫外灯后必须维持黑暗几分钟，避免光复活作用的出现。
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